Real Time PCR (کمی PCR، qPCR) در حال حاضر یک روش کاملاً ثابت برای تشخیص، تعیین کمیت و تایپ عوامل میکروبی مختلف در حوزه‌های تشخیص بالینی، دامپزشکی و ایمنی مواد غذایی است. اگرچه مفهوم ریل تایم پی سی آر یا PCR نسبتاً ساده است، اما مسائل خاصی در qPCR وجود دارد که توسعه دهندگان و کاربران این فناوری باید در نظر داشته باشند.
اگر برای شما هم اصول کار با ریل تایم پی سی آر و مزایای استفاده از آن، جذاب است با ما تا انتهای مقاله همراه باشید.
Real-Time PCR چیست؟
واکنش زنجیرهای پلیمراز (PCR) یک روش متداول برای تقویت DNA است که می‌تواند برای شبیه سازی ژن، توالی یابی و دستکاری ژن استفاده شود. این تکنیک برای تشخیص بیماری نیز به کار گرفته شده است.
مطالعه DNA برای تعیین عملکرد ژن و تأثیر جهش بر بیماری مهم است. تجزیه و تحلیل DNA همچنین امکان توسعه درمان را فراهم می‌کند. در روش PCR، در واقع DNA از یک سلول استخراج و تکثیر می‌شود و هزاران نسخه برای تجزیه و تحلیل تولید می‌شود.
تقویت از طریق استفاده از نوکلئوتیدها و الگوهای mRNA شناخته شده به عنوان آغازگر به دست می‌آید. آنزیمی به نام Taq polymerase پرایمرها را با استفاده از نوکلئوتیدهای آزاد گسترش میدهد و کپیهای یکسانی از ناحیه مورد نظر تولید می‌کند.
اصول کار ریل تایم پی سی آر
از آنجایی که اصول کار با ریل تایم پی سی آر اهمیت بسیار زیادی دارد و نیاز به آگاهی از برخی نکات دارد، ما در این بخش به اصول کار با ریل تایم پی سی آر می‌پردازیم.
مراحل Real-time PCR
اولین مرحله در واکنش PCR بلادرنگ، تبدیل RNA به DNA مکمل (cDNA) است. این فرآیند به عنوان رونویسی معکوس شناخته می‌شود. مرحله بعدی از گزارشگرهای فلورسنت و یک واکنش PCR برای تقویت و شناسایی ژن‌های خاص استفاده می‌کند. دو نوع گزارشگر فلورسنت معمولا استفاده می‌شود.
- کاوشگر سبز SYBR
- کاوشگر Taqman
کاوشگر سبز SYBR و Taqman
SYBR سبز رنگی است که فقط زمانی که به DNA دو رشتهای (یعنی محصول PCR) متصل می‌شود به یک فلورسانس تبدیل می‌شود.
کاوشگرهای Taqman از یک پروب اسید نوکلئیک مخصوص ژن ساخته شدهاند که به مولکولهای گزارشگر و خاموش کننده متصل است. پروب بین پرایمر جلو و معکوس به DNA متصل می‌شود. در حالی که گزارشگر و کوئنچر به پروب متصل هستند، کوئنچر فلورسانس ساطع شده توسط گزارشگر را جذب می‌کند. در طول مرحله گسترش واکنش PCR، پروب تخریب می‌شود، گزارشگر را آزاد می‌کند و اجازه میدهد فلورسانس آن شناسایی شود. مزیت روش Taqman این است که پروبهایی با گزارشگرهای رنگی مختلف میتوانند در سنجشهای چندگانه ترکیب شوند.
برای هر دو روش SYBR سبز و Taqman، مقدار فلورسانس در یک نمونه در “زمان واقعی” تشخیص داده می‌شود و در برابر شماره چرخه رسم می‌شود. مقدار فلورسانس با مقدار محصول PCR متناسب است. نقطه زمانی که فلورسانس به یک آستانه تعریف شده میرسد نسبت به سطح بیان ژن است. طراحی آزمایش‌های PCR بلادرنگ نیازمند دانش قبلی از توالی ژن و بررسی دقیق انواع کنترل‌هایی است که باید شامل شوند.
مزایای استفاده از ریل تایم پی سی آر
مزیت اصلی Real-time PCR نسبت به PCR این است که Real-time PCR به شما امکان میدهد تعداد اولیه کپیهای DNA الگو (توالی هدف تقویت) را با دقت و حساسیت بالا در محدوده دینامیکی گسترده تعیین کنید. نتایج Real-time PCR می‌تواند کیفی (وجود یا عدم وجود یک توالی) یا کمی (تعداد کپی) باشد. بنابراین PCR زمان واقعی کمی به عنوان تجزیه و تحلیل qPCR نیز شناخته می‌شود. در مقابل، PCR در بهترین حالت نیمه کمی است. علاوه بر این، داده‌های qPCR بلادرنگ را می‌توان بدون الکتروفورز ژل ارزیابی کرد که منجر به کاهش زمان بنچ و افزایش توان عملیاتی می‌شود. در نهایت، چون واکنش‌های qPCR بلادرنگ اجرا می‌شوند و داده‌ها در یک سیستم qPCR یکپارچه و لوله بسته ارزیابی می‌شوند، فرصت‌ها برای آلودگی کاهش می‌یابد و نیاز به دستکاری پس از تقویت در تجزیه و تحلیل qPCR حذف می‌شود.
کاربرد ریل تایم پی سی آر
واکنش زنجیرهای پلیمراز (PCR) برای ساخت میلیونها کپی از یک قطعه هدف از DNA استفاده می‌شود. این یک ابزار ضروری در زیست شناسی مولکولی مدرن است و تحقیقات علمی و پزشکی تشخیصی را متحول کرده است.
- پروژه ژنوم انسانی یکی از محرک‌های اصلی بود که به توسعه فناوری ریل تایم پی سی آر کمک کرد و به ما این امکان را داد که ژن‌های مرتبط با فنوتیپ‌های خاص از جمله اختلالات ژنتیکی را شناسایی کنیم.
- ریل تایم پی سی آر به تمرکز بر روی بخش واقعی DNA که مورد توجه است، به جای کل ژنوم کمک می‌کند. اکنون می‌توان از یک نمونه ژنتیکی کوچک، ژنوتیپها را تعیین کرد و در نتیجه بسیاری از اختلالات ژنتیکی را می‌توان شناسایی، تشخیص و پایش کرد. در برخی موارد، ژن درمانی برای رفع این اختلالات در دسترس است و PCR برای نظارت بر عملکرد ژنها و بخش‌های ژنی مربوطه استفاده می‌شود. همچنین از ژنوتیپ برای تعیین جنسیت جنین و همچنین تشخیص اختلالات کروموزومی و ژنتیکی در جنین استفاده می‌شود.
- میکروارگانیسم‌های بیماری‌زا از جمله برخی ویروس‌ها، باکتری‌ها، انگل‌ها و قارچ‌ها باعث ایجاد بیماری‌های عفونی می‌شوند و با استفاده از ریل تایم پی سی آر قابل شناسایی هستند و به تشخیص و درمان مؤثر کمک می‌کنند. مقالات مختلفی در مرکز یادگیری علوم وجود دارد که این تکنیک‌ها را بررسی می‌کنند، از جمله تکنیک‌های آزمایش پاتوژن، آزمایش بیماری لژیونرها، ردیابی زئونوزها و …
- ریل تایم پی سی آر همچنین در تشخیص مولکولی و آنالیزهای بیوشیمیایی استفاده می‌شود. از جمله، این تکنیک‌ها را می‌توان در توسعه دارو، به ویژه در اندازه گیری اثربخشی درمان دارویی و تحقیق در مورد تشخیص و درمان سرطان استفاده کرد.
- فناوری های طراحی شده برای ایجاد محصولات جدید که نیازهای خاص سلامت انسان را برآورده می‌کنند نیز اغلب به عنوان بخشی از فرآیند به PCR متکی هستند.
به عنوان مثال، برخی از محصولات دارویی با اصلاح ژنتیکی (GM) موجودات تولید می‌شوند. این شامل میکروارگانیسم‌های GM برای تولید انبوه داروها مانند انسولین و برخی آنتی بیوتیک‌ها می‌شود.
گاهی اوقات، اصلاح ژنتیکی شامل انتقال ژن از یک موجود به موجود دیگر است، که به این تراریخته میگویند. اگرچه کاربردهای این روش در پزشکی نسبتاً جدید است، اما این یک زمینه تحقیقاتی رو به رشد است.
- فناوریهای پیوند همچنین میتوانند از ریل تایم پی سی آر برای بهبود دقت تایپ بافت استفاده کنند و در نتیجه احتمال رد پیوند را کاهش دهند. حیوانات تراریخته نیز به منظور پیوند خارجی پرورش داده می‌شوند. معمولاً برای این منظور از خوک استفاده می‌شود.
نتیجه گیری
امروزه ریل تایم پی سی آر از آن دست تکنولوژی‌های به شمار میرود که به رشته‌ها و شاخه‌های دیگر پزشکی به خصوص ژنتیک کمک بسیار زیادی می‌کند.
در حالی حاضر با مزایا، اصول کار و کاربرد آن در بخش‌های مختلف آشنایی پیدا کردید. زمان آن رسیده است که برای خرید یا فروش مواد شیمیایی آزمایشگاهی از شرکت‌های حرفه‌ای در این حوزه همچون آرین پژوه کمک دریافت کنید. این شرکت با چنین سال سابقه در زمینه خرید و فروش انواع تجهیزات پزشکی و آزمایشگاهی آماده کمک و خدمت رسانی به شما متقاضیان عزیز است.
